甲基橙在分析化学中是一种常用的酸碱滴定指示剂，不适用于作有机酸类化合物滴定的指示剂。其浓度为0.1%的水溶液pH为3.1（红）～4.4（黄），适用于强酸与强碱、弱碱间的滴定。它还用于分光光度测定氯、溴和溴离子，并用于生物染色等。
甲基橙曾在实验室和工农业生产中用作化学反应的酸碱度控制，以及化工产品和中间体的酸碱滴定分析。甲基橙指示剂的缺点是黄红色泽较难辨认，已被广泛指示剂所代替（见“酚酞”）。甲基橙也是一种偶氮染料，可用于印染纺织品。
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