1 首先确定你的测序片段是否会产生高级结构。 2 在测序时候请注明是RNAi载体，可能会出现二级结构，测序公司一般会改变测序策略来解决产生二级结构的问题。 3 看看你的片段和载体是否有反相互补结构。 4 变性后的退火要缓慢退火，降温不能过快
